蔗糖酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-285

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

蔗糖酶（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，能够水解蔗糖变成相应的单糖 而被机体吸收。

测定原理：

本试剂盒采用 3.5－二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量，由此可得出蔗糖  酶水解速度。其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、沸水浴、可调式移液器、 1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一： 液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支  ，4℃保存，用时加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：液体 5mL×1 瓶，常温保存；

样品测定的准备：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

加样表和测定步骤：

置于 25℃准确水浴 10min

混匀， 95℃水浴 5min 左右（盖紧，防止水分散失），冷却至室温

混匀，520nm 蒸馏水调零，测定各管吸光值 ，ΔA=A 测定-A 对照，每个测定管设一个对 照管。

蔗糖酶活力计算：

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 0.1296x -0.12；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化水解 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T

=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟催化水解 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(μg/min/g  鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T

=771×(ΔA  +0.12) ÷W。

1000 ：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积， 1mL；T：反应时间， 10min；  Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。