可溶性淀粉合成酶试剂盒说明书（分光光度法-25管/24样）

货号：LE-1-090

测定意义

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。

测定原理

SSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP， 在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为  NADPH，NADPH 生成量与前一步反应中ADP 生成量呈正比，340nm 下测定 NADPH 增加  量即可计算 SSS 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液： 液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一 ：25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二 ：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入 7mL 试剂一充分混匀备用； 用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三 ：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入 4mL 试剂一充分混匀备用； 用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四 ：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入 9mL 试剂一充分混匀备用； 用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂五：液体×1支，-20℃保存；临用前加入 0.5mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入 0.5mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

粗酶液制备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。 10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃保温 20 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却

混匀，30℃保温 30 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却， 10000g 4℃离心 10min，取上清液（如果一次性测定样本较多，可将试剂四、五和六按比例配成混合液）

混匀后立即 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。 

注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

SSS 活性计算

1 、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 

SSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍数

=529×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，7.8×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³  L / mol /cm；d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.15 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL； T： 反应时间，2 min；稀释倍数： 1.9；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量。