L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Gal LDH）活性测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-275

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

L-半乳糖途径是合成 AsA 的主要途径。GalLDH 位于线粒体内膜，负责催化植物体内 AsA  生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA 含量的积累起着至关重 要的作用。

测定原理：

Gal LDH 催化 L-半乳糖内酯还原细胞色素 c（Cyt c），还原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰；测 定还原型 Cyt c 增加速率，来计算 GalLDH 活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 40mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水，充分溶解。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

Gal LDH 测定操作：

1、分光光度计预热 30 min ，调节波长到 550nm ，蒸馏水调零。

2、试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3、依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 预热的试剂二和 100μL 试剂三，迅 速混匀后于 550nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2 ，△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性计算公式：

1、按蛋白浓度计算

GalLDH 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原 1μmol Cyt c 为 1 个酶活单位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁶÷（Cpr×V 样）÷T 

=289×△A ÷Cpr

2、按样本质量计算

GalLDH 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还原 1μmol Cyt c 为 1 个酶活单位

Gal LDH (μmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁶÷（W×V 样÷V 样总）÷T

=289×△A ÷W

ε：还原型 Cyt c 摩尔消光系数，17.3×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径(cm) ，1cm；V 反总：反 应体系总体积，1mL=0.001 L；10⁶ ：1mol=1×10⁶μmol；V 样：加入反应体系中上清液体积， 100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL ，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公 司蛋白质含量 BCA 试剂盒；V 样总：加入提取液体积，1mL；W ，样本质量，g；T ：反应 时间，2min。

注意事项:

试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。