吲哚乙酸氧化酶活性测定试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-389

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。

测定原理：

在无机酸存在情况下，吲哚乙酸能与 FeCl3作用，生成红色螯合物，该物质在530nm 处有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、1.5mL 离心管、微量玻璃 比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 65mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂六：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。临用前吸取 1mL 试剂五加入试剂六中混匀，待用，避光保存

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g ，4℃ ,离心 10min ，取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

测定操作：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min ，调节波长到 530 nm ，蒸馏水调零。

2、试剂二、试剂三、试剂四置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 20min。

3、取 1.5mL EP 管若干，操作表如下：

注意：标准管只需做一次

IAA 氧化酶活性计算公式：

a.  使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

IAA 标准曲线公式：y = 1.334x + 0.025  R² = 0.998（x 为 IAA 浓度，mmol /L；y 为吸光值）

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：从开始时加入的 IAA 量减去酶作用后残留的IAA 含量，即得被酶所催化的 IAA 含量。以每mg 酶蛋白在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 样÷（V 样×Cpr÷T 

= 1.5×（A1-A2）÷Cpr

2、按样本鲜重计算

酶活定义： 以每 g 样本在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/g  鲜重）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 样÷(V 样÷V 样总×W)÷T

= 1.5×（A1-A2）÷W

3、按细胞数量计算

酶活定义： 以每 1 万个细胞在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/10⁴ cell）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T 

= 1.5×（A1-A2）÷细胞数量

4、按液体体积计算

酶活定义： 以每mL 酶液在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/mL）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总) ÷T 

= 1.5×（A1-A2）

V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g ，T ：反应时间，0.5h。

注意事项：

最低检出限为 0.01μmol/mL。