淀粉磷酸化酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-088

测定意义：

淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase ，SP）是淀粉代谢过程唯一的可逆反应酶，既可催 化淀粉的合成， 也可催化淀粉的分解。

在高等植物中， 淀粉磷酸化酶（合成方向） 主要存在于质体中， 负责延长淀粉的 α- 1,4- 葡萄糖链的非还原末端； 淀粉磷酸化酶（分解方向）主要存在于细胞质基质中，催化淀粉中 的 α- 1,4-糖苷键磷酸解产生葡萄糖- 1-磷酸，负责葡萄糖链的磷酸解，是淀粉代谢过程中的关 键酶。

在植物体中，淀粉磷酸化酶分解方向的底物无机磷浓度比合成方向的底物葡萄糖- 1-磷 酸浓度几乎高了两个数量级， 一般认为淀粉磷酸化酶只催化淀粉的分解，因此，分解方向的 淀粉磷酸化酶具有重要测定意义。

测定原理：

淀粉磷酸化酶催化淀粉中的 α- 1,4-糖苷键与无机磷反应产生葡萄糖- 1-磷酸，葡萄糖- 1-磷酸在 磷酸葡萄糖变位酶的作用下产生葡萄糖-6-磷酸， 并在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下还原 NADP+产生 NADPH，使 340nm 下吸光值增加。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂一：液体 50mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二： 粉剂×1 瓶， -20℃保存； 临用前加入 3mL 水溶解， 用不完的试剂分装后-20℃保存；

试剂三： 粉剂×1 支， -20℃保存； 临用前加入 3mL 水溶解， 用不完的试剂分装后-20℃保存。

样本的前处理：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆， 然后 10000g ，4℃, 离心 10min，取上清待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g ，4℃, 离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；

2、工作液的配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三按照每个样本 850μL:50μL:50μL 的比 例混合，临用前配制，半小时内使用。

3、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 工作液， 立即混匀， 记录 340nm 处 1min 时的吸光值 A1 和 6min 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

SP 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位定义： 每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷  (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=943×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位定义： 每 g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/g  鲜重） =[ΔA×V 反总÷  (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T =943×ΔA÷W

3、按样本鲜重计算

单位定义： 每万个细胞每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SP（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷  (ε×d）×10⁹]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)÷T =1.886×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1×10^-3  L；ε ：NADPH 摩尔消光系数， 6.22×10³  L / mol /cm；d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL；T： 反应时间， 5 min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量， g；细胞数量， 500 万。