苹果酸合酶（malate synthase ，MS）试剂盒说明书（可见分光光度法）

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

规格：50管/48样

测定意义：

苹果酸合酶（MS，EC 4.1.3.2 ）是属于转移酶中酰基转移酶的一类， 主要存在于植物和微生物中。MS 是乙醛酸循环的关键酶之一，在MS 催化下乙醛酸与乙酰辅酶A 反应生成苹果酸。 

测定原理：

MS 催化乙酰 CoA 和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅酶 A，辅酶 A 使无色的 DTNB 转变成 黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

分光光度计、台式离心机、水浴锅、 可调式移液器、1mL  玻璃比色皿、研钵、冰、和蒸馏 水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 25mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂 分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分 装后-20℃保存， 禁止反复冻融；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL   试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴， 功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。

2、组织： 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1 、分光光度计预热 30min 以上， 调节波长至 412nm ，蒸馏水调零。

2、样本测定

在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 100μL 样本、400μL 试剂二， 400μL 试剂三和 100μL 试 剂四，混匀，立即记录 412 nm 处反应 5min 时的吸光值 A1 和 10min 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

MS 活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=147×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS（nmol/min /g  鲜重）=[ΔA×V 反总÷(ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总） ÷T=147×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷(ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.294×ΔA

V 反总： 反应体系总体积，1×10-3  L；ε：TNB 摩尔消光系数， 1.36×104  L / mol /cm；d：比 色光径，1 cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总： 加入提取液体积， 1 mL；T：反应 时间， 5  min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量， g；500：细胞或细菌总数， 500 万。