离子结合型果胶(ISP)含量试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-328

正式测定前取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

果胶是构成细胞初生壁和中胶层的主要成分，主要由原果胶、果胶酸甲酯和果胶酸组成。 果胶中含有半乳糖醛酸、乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等， 是许多高等植物细胞壁中含量最  丰富的多糖成分， 其独特的物理、化学性质影响着植物源食品的口感和品质。果胶间以 Ca2+  桥及其他离子键、氢键、糖苷键、酯键和苯环偶联的方式交联，  通过不同的抽提方法可以提  取各种形式的果胶，如水溶性果胶（WSP）、离子结合型果胶（ISP）和共价结合果胶（CSP）。 

测定原理：

利用带有螯合剂的酸溶液提取离子结合型果胶（ISP） ，采用咔唑比色法测定果胶含量。果 胶水解成半乳糖醛酸，在硫酸溶液中与咔唑试剂进行缩合反应，  生成物质在 530 nm 处有最大吸收峰。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、 1mL 玻璃比色皿、  80％乙醇、丙酮、浓硫酸（不 允许快递）、研钵和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 50mL× 1 瓶， 4℃保存。

试剂二：液体 50mL× 1 瓶， 4℃保存。

试剂三：标准液 1mL× 1 支， 4℃保存。

试剂四：液体 5 mL× 1 瓶， 4℃保存；

样品的前处理：

1 、 细胞壁的提取： 取约 0.3g 样本， 加入 1mL 80％乙醇，室温快速匀浆， 95℃水浴 20min， 冷却至室温，4000g  25℃离心 10min，弃上清。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一  遍（涡旋振荡 2min 左右， 4000g  25℃离心 10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁，  加入 1mL 试剂一（去除淀粉）浸泡 15 小时， 4000g  25℃离心 10min，弃上清，将沉淀  干燥，称重得细胞壁物质（CWM）。

2 、 ISP 的提取：称取烘干的 CWM 3mg，加入 1mL 试剂二，充分匀浆(若烘干物质质地坚硬， 可先研碎后再加入 1mL 试剂二匀浆， 或者用匀浆器匀浆) 。8000g 4℃离心 10min，取上清液待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上， 调节波长至 530nm 处， 蒸馏水调零； 试剂三和试剂四 37℃ 预热 10min 以上；

2、操作表：

混匀

混匀 95℃水浴 5min 后， 530nm 处读取吸光值，   空白管、标准管、对照管和测定管吸光值分 别记为 A1 、A2 、A3 和 A4。

若 A 大于 2， 需将待测样本用蒸馏水稀释（可稀释 10 倍或 20 倍）。

注意：空白管和标准管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。

ISP 含量计算：

ISP 含量(mg /g  干重)= (C 标准×V1) ×(A4-A3)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2) ×稀释倍数 

=0.05×(A4-A3)÷(A2-A1)÷W×稀释倍数

C 标准： 标准管浓度，0.05mg/mL；V1：加入样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积， 1mL； W：样本干重， g。

注意：最低检测限为 50μg /g  干重