ATP 含量试剂盒说明书(微量法)

货号：LE-2-295

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ATP 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定 ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

测定原理：

肌酸激酶催化肌酸和 ATP 反应生成磷酸肌酸，可在 700nm 下用磷钼酸比色法检测磷酸肌酸 含量， 以此反应 ATP 含量。

自备仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96 孔板、研钵和蒸馏水。

试剂组成和配制：

酸性提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保 存；

试剂二：液体 1.5mL×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存； 临用前加入 500μL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃ 保存一周；

试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

标准液：液体 10mL×1 瓶，2μmol/mLATP 标准液，4℃保存；

ATP 提取：

1、血清（浆） 中 ATP 的提取： 按照血清（浆）体积（mL）： 酸性提取液体积（mL）为 1： 5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），进行冰浴匀浆，8000g 4  ℃离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g  4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

2、组织中 ATP 的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液）， 进行冰浴匀浆，8000g  4℃离心 10min，取上清 至另一 EP 管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g  4  ℃离心 10min，取上 清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

3、细胞或细菌中 ATP 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数 量（10⁴ 个）： 酸性提取液体积（mL）为 500~1000： 1  的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），8000g 4 ℃ 离心 10min；取上清液至另一 EP 管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，8000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 700nm，蒸馏水调零。

2、显色剂的配制： 临用前请根据拟用显色剂体积（样本数×0.2 m L）， 按试剂四(mL)：试 剂五（mL）=1： 5 的比例配制。用多少配多少。

3、样本测定：

充分混匀，37℃准确水浴 30min

37℃水浴 20min 后，700nm 下测定各管吸光值

注意： 空白管和标准管通常只需要各做一个。每个测定管设一个对照管。

ATP 含量计算：

1、血清（浆） 中 ATP 含量计算

ATP 含 量 (μmol/mL)=[C 标 准 管 ×(A 测 定 管 －A 对 照 管 )÷(A 标 准 管 －A 空白 管 ) ×V1]÷(V3×V1÷V2)

=40×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管)

2 、组织、细菌或细胞中ATP 含量计算

（1）按蛋白浓度计算

ATP 含量(μmol/mg  prot)=[C 标准管×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管)×V1]÷(V1÷Cpr）

=2 ×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管)÷Cpr

蛋白质含量需要另外测定。

（2）按样本鲜重计算

ATP 含量 μmol/g 鲜重)=[C 标准管×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)

=4 ×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

ATP 含量(μmol/10⁴  cell） =[C 标准管×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.008×(A 测定管－A 对照管)÷(A 标准管－A 空白管)÷W

C  标准管 ：标准液浓度，2μmol/mL；V1 ：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2 ：加入  提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W： 样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万。

注意： 最低检测限为 10nmol/mL 或 10nmol/g 鲜重或 0.1nmol/mg prot