货号：LE-1-199

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：6mol/L 盐酸，自备。浓盐酸：H₂O（V/V）= 1:1，室温保存。

试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

标准品：液体 1mL×1 支，0.5mg/mL 羟脯氨酸标准品，4℃保存。

产品说明：

HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此 HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

样品经酸水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。

自备实验用品及仪器：

天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、6mol/L 盐酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、羟脯氨酸提取

1、组织：称取约 0.5g 样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入 5mL 的提取液，煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心 20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用 10mol/LNaOH（约 3mL）调节 pH 值至 6～8 范围内。蒸馏水定容至 8mL，取上清待测。（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质）

2、细胞：取500 万个细胞，加入1mL 的提取液，煮沸或110℃烘箱2 至6 小时消化至透明状，16000rpm， 25℃，离心 20min，用 10mol/LNaOH（约 0.5mL）调节 pH 值至 6～8 范围内。蒸馏水定容至 2mL， 取上清待测。

二、测定操作：

1、将标准品稀释为 15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117µg/mL 的标准溶液。

2、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。

3、按下表进行操作：

1、标准曲线的绘制：

以标准溶液的浓度为x 轴，∆A 标准（∆A =A 标准管-A 空白管）为 y 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将∆A 测定（∆A =A 测定管-A 空白管）带入方程得到 x。

2、羟脯氨酸含量的测定：

（1）按样本鲜重计算：

组织羟脯氨酸含量（µg/g 鲜重）= x×V 样品÷（W×V 样品÷V 组提）=8x÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：

组织羟脯氨酸含量（µg/mg prot）= x×V 样品÷（Cpr×V 样品）=x÷Cpr

（3）按细菌或细胞数量计算：

细胞羟脯氨酸含量（µg/10⁴ cell）= x×V 样品÷（细胞数量×V 样品÷V 胞提）=2x÷细胞数量。

V 样品：加入的样品体积，0.2mL；V 组提：组织提取液体积，8mL；V 胞提：细胞提取液体积，2mL；W：样本鲜重，g；细胞数量：以 104 为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

1、OD 值大于 1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。