酰基转移酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法-25T)

货号：LE-2-142

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAT 是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT 催化乙酰 CoA 转移乙酰基到丁醇，释放的 CoA 还原 DTNB 生成TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，测定 412 nm吸光度增加速率可计算 AAT 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、 1mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、无水乙醇。

试剂组成和配制：

提取液：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。

试剂三：粉剂×1支，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。 8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）： 提取液体积（mL）为 500~1000： 1  的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃,离心 10min， 取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

AAT 测定操作：

1、 分光光度计预热 30min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2、 工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入 22.5mL 试剂一，充分混匀待用。 用不完的试 剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、 试剂三的配制： 临用前加无水乙醇 1.25mL 充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。

4、 空白管：在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 提取液和 900μL 工作液，充分混匀，35℃反应 15min，加入 50μL 试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm 处吸光值，记为 A 空 白管。

5、 测定管： 在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 样本和 900μL 工作液，充分混匀，35℃反应 15min，加入 50μL 试剂三，充分混匀，25℃静置 10min，测定 412nm 处吸光值，记为 A 测 定管。△A=A 测定管- A 空白管，空白管只要做一管。

AAT 活性计算公式：

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /mg prot) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 98.04×△ A÷Cpr

2、按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /g  鲜重) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反总÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

= 98.04×△ A÷W 

3、按细胞数量计算

活性单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。 AAT (nmol/min /10⁴ cell) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T

= 98.04×△ A÷ 细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。 

AAT (nmol/min /mL) = △ A ÷ (ε ×d）×V 反总÷V 样÷T

=98.04×△ A

ε ：TNB 消光系数， 13600L/mol/cm；V 反总：反应总体积， 1mL；V 样：加入反应体系中 上清液体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL； Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样 本质量，g；T：反应时间， 15 min。