海藻糖含量测试盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-221

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；

标准品：粉剂×1 支，含 10mg 海藻糖。

产品说明：

海藻糖存在于大量有机体中，包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有独特的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

测定原理：

测定方法采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果样本中含有可溶性糖，则会影响测定。本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研钵、浓硫酸和蒸馏水。

操作步骤：

一、海藻糖提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），室温静置 45min，振荡 3~5 次，冷却后，8000g，常温离心，取上清。

2、组织的处理：称取约 0.1g 样本，常温研碎，加入 1mL 提取液，室温静置 45min，振荡 3~5 次， 冷却后，8000g，常温离心，取上清。

3、血清（浆）的处理：吸取约 100μL 血清（浆），加入 0.9mL 提取液，室温静置 45min，振荡 3~5次，冷却后，8000g，常温离心，取上清。

4、标准品的处理：标准品用 1mL 双蒸水溶解，溶液浓度为 10mg/mL，稀释到 0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0mg/mL。

二、测定操作表：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 620nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至 95 度。

3、工作液的配制：临用前在每瓶试剂一中加入 16mL 蒸馏水后，缓慢加入 64mL 浓硫酸，不断搅拌， 充分溶解，待用。用不完的试剂 4℃保存一周。

4、标准曲线的建立：取 0.25mL 标准液和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 处测吸光值 A。根据标准样本的浓度（y）和吸光度（x）建立标准曲线。

5、样本测定：取 0.25mL 样本和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（盖紧，防止水分散失）， 自然冷却至室温，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 处测吸光值 A。

注意：若吸光值大于 1，请将样本用提取液稀释后再测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数。

三、海藻糖含量计算：

1、根据标准曲线计算样本中海藻糖的含量 y（mg/mL）。

2、按样本鲜重计算：

海藻糖含量(mg/g 鲜重)= V1×y÷(W×V1÷V2)=y ÷W。

3、按样本蛋白浓度计算：

海藻糖含量(mg/mg prot)=V1×y÷(V1×Cpr)=y÷Cpr。

4、按细菌或细胞数量计算：

海藻糖含量(μg/10⁴ cell)=（1000 × V1 × y）÷(500 × V1÷V2)=2× y

5、按血清（浆）体积含量计算

海藻糖含量（mg/mL）＝(V1×y)÷(V3×V1÷V2)=10×y

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，0.25 mL；V2：提取液总体积，1mL； V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。