硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-311

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

诱导剂储备液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。10 倍稀释后使用，现配现用。

提取液：液体 80mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 30mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入5mL提取液溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻融。-20℃可保存 2 周。

诱导剂应用液的配制：

用时将诱导剂储备液用水稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。

产品说明：

NR（ EC 1.7. 1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对 作物的产量和品质有影响。

NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3¯+NADH+H＋→ NO2¯ +NAD＋ +H2O，NADH 在 340nm 下 有特征吸收峰，340nm 下吸光值的变化即可表示酶活。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品测定的前处理

1 、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可） 避光， 浸泡2h ，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min ，取出样本，滤纸吸干。 （根据需要进行诱导处理）

2 、称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴研磨，4000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1 、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2 、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂）

充分混匀后测定 340nm 下的初始值 A1 ，25℃（其他物种） 或 37℃（哺乳动物） 反应 30min 后 再次测定吸光值 A2 ，计算△A 测定管=A1 测定管-A2 测定管，△A 空白管= A1 空白管-A2 空白管，△A=△A 测定管-△A 空白管。

注意：白管只需测 1-2 次。

三、NR 活性计算：

（1）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每小时每 g 鲜重样品中消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。 

NR（U/g 鲜重） =[∆A×V 反总÷ （ ε×d）×106]÷(W÷V 提取×V 样) ÷T=5.359×∆A÷W。

（2）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每小时每 mg 组织蛋白消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。 

NR（U/mg prot）=[∆A×V 反总÷ （ ε×d）×106]÷(V 样×Cpr)÷T=5.359×∆A÷Cpr。

V 反总：反应体系体积，0.001L；V 样： 吸取样本体积，0.06mL；V 提取： 加入提取液体积， 1mL；T：反应时间，0.5h；ε：NADH 的摩尔消光系数： 6220 L/mol/cm；d：比色皿光径： 1cm；Cpr： 样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；106：单位换算系数，1mol=106µmol。

注意事项

1、 当测定的吸光值大于 1.5 或者∆A 大于 0.6 时，建议将上清液稀释后测定。

2、 ∆A 测定过小（小于 0.01），可延长酶促反应时间。

3、 建议一次测定不要测定过多样品以免耽误过多的酶促反应时间。

4、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，空白管的初始测定值（A1 空白管）在 0.9 左右，变化不超过0.05。