Na⁺K⁺- ATP酶活性测定说明书(分光光度法）

货号：LE-1-297

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Na⁺K⁺- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机 磷。

测定原理：

Na⁺K⁺- ATP酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。 

试剂一：液体 10mL×1 瓶 ，4℃保存。

试剂二：液体 5mL×1 瓶 ，4℃保存。

试剂三：液体 5ml×1 瓶 ，4℃保存。

试剂四：粉剂×3 支，-20℃保存。用时每支加 1mL 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存， 禁止反复冻融。

试剂五：液体 5mL×1 瓶 ，4℃保存。

试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水，4℃保存。

试剂七：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。

试剂八：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。 

试剂九：液体 25mL×1 瓶，室温保存。

试剂十： 10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL  标准磷应用液配制：将贮备液 20 倍稀释，即取  0.1mL 试剂十加 1.9mL 蒸馏水充分混匀。

定磷剂的配制：按 H2O:  试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1  的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色 。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

样品酶液的制备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提  取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

操作步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）

混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min

混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液

3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列试剂)

            混匀，室温放置 30 min，在  660nm 处比色。

注意：

1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 50 管保证测 24 份 Na⁺K⁺- ATP酶。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。

3、空白管和标准管只要做一管。

计算方式：

1、血清（浆） Na⁺K⁺- ATPase 活力的计算:

定义：每小时每毫升血清（浆） 中 Na⁺K⁺- ATP酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺- ATP酶活力(μmol/h/mL）=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷V 样÷T

=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

2、组织、细菌或细胞中 Na⁺K⁺- ATPase 活力的计算：

（1）按蛋白浓度计算：

定义：每小时每毫克组织蛋白中 Na⁺K⁺- ATP酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺- ATP酶活力(μmol/h /mg)= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空 白管）÷（Cpr×V 样）÷T

=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

定义：每小时每克组织中Na⁺K⁺- ATP酶分解 ATP  产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺- ATP酶活力(μmol/h/g)= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白 管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

定义：每小时每 1 万个细菌或细胞中 Na⁺K⁺- ATP酶分解 ATP  产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺- ATP酶活力(μmol/h /10⁴）= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空 白管）÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.015×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体 积，0.2mL  ；V 样总：加入提取液体积， 1mL；T： 反应时间， 1/6 小时；Cpr：样本蛋白质 浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。