酪氨酸解氨酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-180

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

TAL 广泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。TAL 能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）直接将酪氨酸转化为香豆酸，香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。

测定原理：

TAL 能够分解酪氨酸产生香豆酸，使反应溶液 333nm 下的吸光度随反应时间而上升，根据吸光度的变化率可计算出TAL 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）果汁等液体样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。

2、试剂二的配置：临用前在试剂二瓶中加入 15mL 试剂一充分溶解待用（用不完的试剂 4℃ 保存一周，注意现配现用），在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。

3、在EP 管中依次加入如下试剂

混匀，10000g4℃离心 5min，取 0.8~1mL 上清至 1mL 石英比色皿，333nm 下测定吸光值 A测定与A 对照，ΔA=A 测定-A 对照

TAL 活性计算：

1、血清（浆）或果汁 TAL 活性

单位的定义：每分钟每 mL 血清（浆）或果汁在每 mL 反应体系中使 333nm 处吸光值变化0.01 为一个酶活力单位。

TAL（U/mL）=ΔA×V 反总÷( V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=17.5×ΔA

2、组织、细菌或细胞 TAL 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中使 333nm 处吸光值变化 0.01 为一个酶活力单位。

TAL（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr ）÷0.01÷T

=17.5×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每 g 组织在每 mL 反应体系中使 333nm 处吸光值变化 0.01 为一个酶活力单位。

TAL（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=17.5×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中使 333nm 处吸光值变化 0.01 为一个酶活力单位。

TAL（U/10⁴ cell）=ΔA×V 反总÷( 500×V 样÷V  样总)÷0.01÷T

=0.035×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.05mL；V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500： 细胞或细菌总数，500 万。