乙醇脱氢酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-140

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着 重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD+没有； 测定 340nm  吸光度下降速率，来计算 ADH 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×2 瓶，－20℃保存。临用前加入 22mL 试剂二，现配现用。(注意：试剂三为 微量粉剂可能肉眼看不见，正常溶解即可）

试剂四：液体×1 支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g ，4℃离心 20min ，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~ 1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）； 16000g ， 4℃离心 20min ，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

ADH 测定操作：

1、分光光度计预热 30 min ，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

2、试剂三在 25℃水浴中保温 30 min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 样本上清液、800μL 试剂三和 100μL 试剂四，迅速 混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1 和 A2。 △A 测定管=A1-A2。

计算公式：

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(Cpr×V 样)÷T 

= 1608×△÷Cpr

2、按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 1608×△A÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位

ADH (nmol/min/10⁴ cell) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T 

= 1608×△A ÷细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1nmol NADH  为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷V 样÷T 

= 1608×△A

ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d： 比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总 体积，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V 样：加入 反应体系中上清液体积，100μL=0. 1 mL；T ：反应时间，1min。