游离胆固醇含量测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-147

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

FC 是构成细胞膜的主要成分，也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素 D等生理活性物 质的重要原料 。FC 浓度可作为脂代谢的指标。

测定原理：

FC 氧化酶催化 FC 生成△4-胆甾烯酮和 H2O2 ，过氧化物酶催化 H2O2 、4-氨基安替比林和酚生成红色醌 类化合物，在 500nm 有吸收峰，其颜色深浅与 FC 含量成正比。

试剂盒的组成：

试剂一：异丙醇（自备）50 ml ×1 瓶

试剂二：液体 50ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂 × 1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 100μl ×1 瓶，4℃保存。

TC标准品：液体 1ml×1 支 ，0.5μmol/ml，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、水浴锅 、可调式移液枪 、 1ml 玻璃比色皿 、异丙醇和蒸馏水。

FC 的提取：

1 、组织：按照组织质量（ g） ：试剂一体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 试剂 一）进行冰浴匀浆 。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：先收集400-500 万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加 1ml 试剂一，超声波破碎 1min（强 度 20％ ，超声 2s，停 1s） ，即 FC 待测液。

3、血清（浆）样品：直接测定。

测定操作：

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 500 nm，蒸馏水调零。

2、FC 工作液的配制：临用前，吸取约 0.8ml 试剂二分别加入试剂三和试剂四瓶中，充分溶解后再全部转移回试剂二瓶中，充分混匀，FC 工作液置于 37℃水浴 10min 。用不完的工作液 4℃保存一周。

3、标准管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl FC 标准液和 900μl FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于 500nm 测定 A 标准管。

4、测定管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl FC 待测液和 900μl FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于 500nm 测定 A 测定管。

5、空白管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl  试剂一和 900μl FC 工作液，混匀，37℃静置 3h 后于 500nm 测定 A 测定管。

注意事项：

1、标准管和空白管只需测定一次。

2、若测定管产生白色浑浊，可以将待测液用异丙醇稀释 2~5 倍后测定，并在最后结果乘以相应倍数。

FC计算公式：

1、血清（浆） 中 FC 含量计算：

FC 含量( μmol /dL）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）×100ml 

=50×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）

C 标准液：0.5μmol/ml； 100 ml： 1dL= 100 ml。

2、组织中FC 含量计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

FC 含量( μmol / mg prot）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr 

= 0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

FC 含量  ( μmol / g 鲜重）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W 

= 0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W

C 标准液：0.5μmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml

3、细胞、细菌中FC 含量计算：

FC 含量  ( μmol /10⁴ cell）= C 标准液×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷细菌或细胞（10⁴  cell /L）

=0.5×（A 测定管-A 空白管）÷（A 标准管-A 空白管）÷细菌或细胞（ 10⁴ cell /L）

C 标准液：0.5μmol/ml。

试剂盒最低检出限为 1nmol/ml。