还原型谷胱甘肽试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-264

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GSH 是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要 作用 。还原型与氧化型比值（ GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标 。因此，测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

测定原理：

DTNB 与 GSH 反应生成复合物，在 412nm 处有特征吸收峰；其吸光度与 GSH 含量成正比。

产品内容：

试剂一：液体 ×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 ×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 ×1 瓶，4℃避光保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、低温离心机 、水浴锅 、可调节移液器 、 1ml 玻璃比色皿和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（ g）：试剂一体积(ml)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 试剂 一）进行冰浴匀浆 。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌 、真菌：按照细胞数量（ 10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加  入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃,   离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

GSH 测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。

3、空白管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 100μl 蒸馏水，700μl 试剂二，200μl 试剂三，混匀静置 2min 后 测定 412 nm 吸光度 A1。

4、测定管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 100μl 上清液，700μl 试剂二，200μl 试剂三，混匀静置 2min 后 测定 412 nm 吸光度 A2。

注意 ：空白管只需要测定一次。

GSH 含量计算公式：

GSH 标准曲线公式：y= 1.5 x（x 为 GSH 浓度，μ mol /ml；y 为吸光值） 

GSH 计算：

1、按蛋白浓度计算

GSH ( μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷ 1.5×V 样÷（V 样×Cpr  ）

=0.667×(A2－A1) ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

GSH ( μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷ 1.5×V 样÷(V 样÷V 样总×W)

=0.667×(A2－A1) ÷W

3、按细胞数量计算

GSH ( μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷ 1.5×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)

=0.667×(A2－A1) ÷细胞数量

4、按液体体积计算

GSH ( μ mol/ ml）=(A2－A1) ÷ 1.5×V 样÷V 样  

=0.667×(A2－A1)

V 样总：上清液总体积，1 ml；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μl=0.1 ml；W：样品质量，g  ；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/ml；

注意事项：

1、试剂一中含有蛋白质沉淀剂， 因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

2、最低检出限为 0.01mmol/L。