纤维素酶/羧甲基纤维素酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-102

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

CL（EC 3.2.1.4 ）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。

测定原理：

采用蒽酮比色法测定CL催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、浓硫酸和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；  临用前加入 5mL 蒸馏水和 45mL 浓硫酸充分溶解待用。

样品测定的准备：

1 、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提  取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2 、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3 、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 620nm，蒸馏水调零。

2、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

37℃振荡反应 1h 后 ，90℃水浴 15min（盖紧，防止水分散失），冷却后 8000g 25℃离心 10min，取上清，得糖化液

混匀 ， 90℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），冷却 ，620nm 处蒸馏水调零，测定吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管 。每个测定管设一个对照管。

CL 活力计算：

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 5.018x - 0.0462；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。

2、血清（浆）CL 活力的计算

单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷V 样÷T

=39.8×(ΔA+0.0462)

3、细胞、细菌和组织中CL 活力的计算

（1）按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL 活力(μg /min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(V 样×Cpr) ÷T

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL 活力(μg /min /g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T 

=39.8×(ΔA+0.0462) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL 活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0462) ÷5.018×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T 

=0.0796×(ΔA+0.0462)

1000： 1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，1.2mL； V 样：加入样本体积，0.1  mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g； 500 ：细菌或细胞总数，500 万。