碳酸酐酶（CA）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-377

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ，CA)是一种含锌金属酶，迄今在哺乳动物体内已发现至少有  11种同工酶，它们的结构、分布、性质各异， 多与各种上皮细胞泌H-和碳酸氢盐有关，通  过催化CO2水化反应及某些脂、醛类水化反应，参与多种离子交换 ，维持机体内环境稳态。 

测定原理：

碳酸酐酶具有酯酶活性， 可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基苯酚， 通过检测 405nm 处 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存；临用前加入 12mL 试剂三， 充分溶解待用， 用不完的 试剂继续-20℃避光保存。

试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）： 提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次） ；8000g ，4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。

2、组织的处理： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） ，冰浴中匀浆。 8000g  ，4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。 

测定步骤

1、分光光度计预热 30min，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

2、试剂一、试剂二提前 25℃预热 10min。

3、取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 样本上清，700μL 试剂一，最后加入 200μL 试剂二。立刻混匀，测定 405nm 下 3min 处吸光值 A1  与 6min 处吸光值 A2 ，ΔA=A2-A1

CA 活力计算：

标准条件下测定回归方程为 y = 2.0848x + 0.001，R² = 0.9994；x 为标准品浓度(μmol/mL）， y 为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 对硝基酚定义为一个酶活力单位。 

CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 样÷(V 样×Cpr)÷T×1000

=159.89×(ΔA-0.001) ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol  对硝基酚定义为一个酶活力单位。 

CA 活性(nmol/min/g  鲜重)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 样÷(W ×V 样÷V 样总)÷T×1000

=159.89×(ΔA-0.001) ÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol  对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA 活性(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.001) ÷2.0848×V 样÷(500 ×V 样÷V 样总)÷T×1000 

=0.319×(ΔA-0.001)

V 样：加入样本体积： 0.1mL；V 样总：加入提取液体积， 1  mL；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数， 500 万；T：反应时间，3min；1000，μmol 到 nmol 的换算系数。