货号：LE-1-203

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

谷氨酸脱羧酶是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的限速酶，γ-氨基丁酸是中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有降血压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促进生长激素分泌和保肝利肾等作用，目前在医药和保健食品中已有广泛的应用。

测定原理：

GAD 催化谷氨酸产生 GABA，利用 berthelot 反应测定 GABA 含量，从而测定 GAD 活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 6mL×1  瓶，4℃保存；

试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存；

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：液体 10mL×1  瓶，4℃保存；

试剂五：液体 20mL×1 瓶，4℃避光保存；

试剂六：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂七：液体 35mL×1  瓶，4℃保存。

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、在EP 管中加入如下试剂

混匀，40℃水浴反应 1h，95℃水浴 10 分钟终止反应，冷却至室温，取反应液待用。

2、在新 EP 管中加入如下试剂

混匀，室温静置 5min。

混匀，室温静置 5min。

混匀，取 1mL 于 1mL 玻璃比色皿，测定 640nm 下吸光值 A 测定与A 对照，ΔA=A 测定-A 对照，每个测定管设一个对照管。

GAD 活力计算：

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.1364x - 0.0432，R² = 0.999；x 为标准品浓度（μmol/mL），y 为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。

GAD 活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T

=0.366×(ΔA+0.0432) ÷Cpr

3、按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。

GAD 活力(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总)÷T

=0.366×(ΔA+0.0432) ÷W

4、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。

GAD 活力(μmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总)÷T

=0.0007×(ΔA+0.0432)

V 样：加入样本体积：0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体积， 0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万； T：反应时间，60min。