过氧化氢含量试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-164

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

H2O2 是生物体内最常见的活性氧分子，主要由 SOD 和 XOD 等催化产生， 由 CAT 和 POD 等催化降 解 。H2O2 不仅是重要的活性氧之一 ，也是活性氧相互转化的枢纽 。一方面，H2O2 可以直接或间接地氧化 细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面 H2O2  也是许多氧化应急反应中的关键调节因子。

测定原理：

H2O2 与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在 415nm 有特征吸收。

试剂的组成和配制：

试剂一： 丙酮 60mL×1 瓶，4℃保存；（自备）

试剂二：粉剂×1瓶 ，4℃保存；临用前加入 10ml 浓盐酸充分溶解备用 。用不完的试剂 4℃保存；(溶 解时间较长，约 30min，可 40℃-60℃加热溶解，务必提前准备)

试剂三： 液体 15mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂四： 液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、 台式离心机 、可调式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、丙酮 60ml 、浓盐酸 10ml 、研钵和 冰。

H2O2 提取：

1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 试剂一） ，超声波破碎 细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；用试剂一定容至 1ml；8000g 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织样品的制备：按照组织质量（ g） ：试剂一体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组 织 ，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆；转移至 EP 管中，用试剂一定容至 1ml，8000g 4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 415nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二 、三和四 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。

3、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

4000g，25℃离心 10min，弃上清，留沉淀

加入试剂四溶解沉淀后，室温静置 5min，倒入比色皿中，测定 415nm 处吸光值 A 。对照管只要做一 次即可 。计算ΔA＝A 测定-A 对照。

注意事项:

1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。

2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。

H2O2 含量计算：

1、标准条件下测定的回归曲线，y = 0.7488x + 0.0006 (x 为标准品浓度，μmol/ml；y 为ΔA)。

2、血清（浆） 中 H2O2 含量的计算：

H2O2 含量  ( μmol/ml）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488

= 1.34×(ΔA-0.0006)

3 、细菌 、细胞或组织中 H2O2 含量计算

（ 1）按照蛋白浓度计算

H2O2 含量(μmol/mg prot)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)

= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2）按照样本质量计算

H2O2 含量(μmol/g 鲜重)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)

= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

（3）按照细菌或细胞密度计算：

H2O2 含量(μmol/10⁴)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反应体系中样本体积， 1ml；V2：加入提取液体积， 1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注意：

标曲线性范围为 0. 1μmol/ml 到 2μmol/ml，吸光度ΔA 线性范围为 0.07-1.5 ，若ΔA 超过 1.5 则需 要稀释，计算公式乘以相应稀释倍数。