中性转化酶试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-290

测定意义：

蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖  代谢关键酶之一。根据最适 pH，将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI） 两种类型。

NI 主要存在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。

测定原理：

NI 催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合 物，在 510nm 有特征光吸收，在一定范围内510nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性 

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、 1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存; 

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存;

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存； 临用前加入 25mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；

试剂三：液体 30mL×1 瓶，4℃保存； 

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）， 进行冰浴匀浆。 12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 

测定步骤和加样表：

混匀， 37℃准确水浴 30min 后，95℃水浴 10min（盖紧， 以防止水分散失），流水冷却后充 分混匀（以保证浓度不变）

混匀，95℃水浴 10min（盖紧， 以防止水分散失），流水冷却后充分混匀， 510nm 处蒸馏水 调零，记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式中乘以 相应稀释倍数）， ΔA=A 测定-A 对照。

NI 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001；x 为标准品浓度(μg/mL）， y 为吸光值。

1、按蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。

NI 活性(μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T

=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2、按鲜重计算：

单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。

NI 活性(μg /min/g  鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2)÷T

=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.2mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。