γ-谷氨酰转肽酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-272

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

γ-GT 是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化 GSH 降解。γ-GT 催化 GSH 或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ- 谷氨酰基转移到受体。也可以催化 GSH 和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘 肽新陈代谢中起了重要的作用。

测定原理：

γ-GT 催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给 N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在 405nm 有特 征光吸收；通过测定 405nm 光吸收增加速率，来计算γ-GT 酶活性。

试剂组成和配制：

试剂一 ：液体 50ml ×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 10ml×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 37ml×1 瓶，4℃保存。

工作液（在试剂二瓶中配制） ：临用前配制，把试剂三倒入试剂二瓶中，充分溶解（室温过低时可以 40℃水浴促进溶解） ；然后把试剂四倒入试剂二瓶中，混匀后室温保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、低温离心机 、水浴锅 、可调节移液器 、 1ml 玻璃比色皿和蒸馏水

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（ g）：试剂一体积(ml)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 试剂 一）进行冰浴匀浆 。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2、细菌 、真菌：按照细胞数量（ 10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加  入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃,   离心 15min，取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

γ-GT 测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 405 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30min（保证无沉淀）。

3、测定管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 100μl 上清液，900μl 工作液，混匀后于 405nm 测定 10 s 和 70 s 时吸光度，记为 A1 和 A2。

γ-GT 活性计算公式：

标准曲线：y=0.006x+0.0016，x 为对硝基苯胺浓度，y 为吸光值，R²=0.999。

1、按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT ( μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反总÷（ Cpr×V 样）÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

2、按样本质量计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT ( μmol/min/g  鲜重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T 

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT ( μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T 

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为 1 个酶活单位。γ-GT  ( μmol/min/ml）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V 反总÷V 样÷T 

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V 反总：反应体系总体积（L） ，1000μl=0.001 L；Cpr：蛋白浓度（mg/ml）；V 样：反应体系中加入上清  液体积（ml） ，100μl=0.1 ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；W ，样本质量，g；T：反应时间（min）， 1min。

注意事项：

1、培养细胞中γ-GT 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中γ-GT 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞（防止因为蛋白质变性导致酶失活）。

2、配置好的工作液 2 周内使用完毕。