谷胱甘肽还原酶说明书(分光光度法)

货号：LE-1-269

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环 的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有 助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。

测定原理：

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反 NADP+在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测 定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水

试剂组成和配置：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存。临用前加入 3 mL 蒸馏水，混匀。

试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，混匀。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g ，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1  的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g ，4℃, 离心 15min，取上清置于冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

操作步骤：

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min。

3、测定管：取 1mL 石英比色皿，依次加入 50μL 试剂三，100μL 试剂二， 750μL 试剂一， 100μL 上清液，混匀，于 340nm 迅速测定初始吸光度和 180  s 吸光度，记为 A 测 1 和 A 测 2 ，△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2 。(注意加完上清液后迅速混匀测定)

计算公式：

1、按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化 为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷[Cpr×V 样]÷T 

= 536×△A 测定管÷Cpr

2、按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g  鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 536×△A 测定管÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧 化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T 

= 536×△A 测定管÷细胞数量

4、按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化 为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷×V 样÷T 

= 536×△A 测定管

ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总 体积，1000μL=0.001 L；10⁶ ：1 mol=1×10⁶ μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V 样： 加入反应体系中上清液体积，100μL =0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本 质量，g；T：反应时间，3 min。

注意事项：

1、样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

2、试剂二和试剂三须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天内使 用完。

3、测定前须先用 1～2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2～5 倍。

4、细胞中 GR 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GR 的提取时可加 试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。