还原糖含量试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-098

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、 果糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物， 也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。

测定原理：

加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有 特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：15mL×1 瓶 ，4℃保存； 

样品中还原糖的提取：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 1000 万细菌或细胞加入 2mL 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min 并且振荡 8~ 10 次， 8000g ，25℃离心 10min，取上清供测定用。

2 、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.2g 组织，加入 2mL 试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃ 水浴中 40min 并且振荡 8~ 10 次，8000g ，25℃离心 10min ，取上清供测定用。

3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建 议取 0.2mL 血清（浆）加入 2mL 试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水 分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~ 10 次，8000g，25℃离心 10min，取上清供测定用。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2 、调节水浴锅至 95℃。

3、在 EP 管中加入下列试剂：

将各管摇匀，在 95℃水浴中加热 5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温， 混匀。在 540nm 波长下读取对照管和测定管吸光值。计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

注意：如果 ΔA 大于 2，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数（若显色 后出现分层现象，可改用蒸馏水稀释）。

还原糖含量计算：

1、标准条件下测定回归方程为 y = 8.3796x- 0.3034；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。

2、按样本鲜重计算：

还原糖(μg/g 鲜重)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(W×V1÷V2)

=238.67×(ΔA＋0.3034)÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷(V1×Cpr)

=119.34×(ΔA＋0.3034)÷Cpr

4、按细菌或细胞密度计算：

还原糖(μg /10⁴ cell)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷（1000×V1÷V2）

=0.239×(ΔA＋0.3034)

5、按血清（浆）体积计算：

还原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋0.3034)÷ 8.3796×V1]÷[V3×V1÷(V2+V3）]

=1312.7×(ΔA＋0.3034)

1000 ：1mg/mL=1000µg/mL；V1 ：加入样本体积，0.7mL；V2：加入提取液体积，2  mL； V3：加入血清（浆体积），0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1000： 细菌或细胞总数，1000 万。

注意：最低检测限为 1mg/g 鲜重或 10μg/mg prot