α-半乳糖苷酶 (α-GAL）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-109

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化 α 半乳糖  苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL  对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅  速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源 ，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 

测定原理：

α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通过测定吸光值升高速率来计算 α-GAL 活性。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、 水浴锅、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶， -20℃保存；临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试 剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量  （10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提  取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

迅速混匀，放入 37℃准确水浴 30min

充分混匀，400nm 处测定吸光值 A，计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

α-GAL 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y =0.00543x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值。

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/min /g 鲜重) ＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T 

=0.123×(ΔA +0.0027)

V 反总：反应体系总体积，0.5mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加 入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细 菌总数，500 万；T：反应时间，30min。