几丁质酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-104

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

几丁质主要存在于虾 、蟹 、 昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)， 以及真菌 类的细胞壁中 。而几丁质酶(EC 3.2.1. 14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害  的研究热点。

测定原理：

几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在 585nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100ml×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体10ml×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体10ml×1 瓶，4℃保存；若出现结晶，可 80℃ 左右加热溶解后使用）

试剂三：液体10ml×1 瓶，4℃保存；

试剂四：液体20ml×1 瓶，4℃避光保存；

自备仪器和用品：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 ml 玻璃比色皿、蒸馏水。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（ g） ：提取液体积( ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1 ml 提 取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。

2、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1 ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃,  离心 20min，取上清置于冰上待测。

3、培养液：直接测定。

测定操作表：

计算公式：

标准曲线：y=0.3088-0.003，R²=0.9995 

计算公式：

1、按照样本重量计算

酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单 位。

几丁质酶活性（mg/h/g 鲜重）=( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T 

=8.096×( ΔA +0.003）÷W

2、按照蛋白质浓度计算

酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。

几丁质酶活性（mg/h mg prot）=( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T 

= 8.096×( ΔA +0.003）÷Cpr

3、按细胞数量计算

酶活定义：37℃条件下，每 10⁴ 个细胞每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单 位。

几丁质酶活性（mg/h /10⁴ cell）= ( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) 

=8.096×( ΔA +0.003）÷细胞数量

4、按液体体积计算

酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单 位。

几丁质酶活性（mg/h / ml）= ( ΔA+0.003）÷0.3088×V 反总÷V 样

=8.096×( ΔA +0.003）

V 反总：反应体系总体积， 1 ml；V 样：反应体系中样本体积，0.4 ml；V 样总：加入提取液体积， 1 ml； W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ ml

注意事项：

1、反应结束后立即进行比色。

2、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措。