多聚半乳糖醛酸酶试剂盒说明书(分光光度法 )

货号：LE-1-322

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一种细胞壁结合蛋白，可以催化果胶分子中 α-(1,4)-聚半 乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化，与果实成熟、叶和 花的脱落、病原物防御，细胞伸展发育以及木质化有关，在植物抗病性和食品贮藏保鲜领域 具有较高的研究价值。

测定原理

多聚半乳糖醛酸酶水解果胶酸生成半乳糖醛酸，具有还原性醛基，与DNS 试剂反应生成红 棕色物质，在 540nm 有特征吸收峰，测定540nm 处吸光值变化可计算得多聚半乳糖醛酸酶 活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计、 1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。 16000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌、真菌：  按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000： 1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）； 然后 16000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、培养液：直接检测。

测定操作表

酶活性计算公式

标准曲线：y = 3.9642x - 0.008；R²  = 0.9996；x 为标准品浓度，mg/mL；y 为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

酶活性定义： 在 40℃, pH6.0 条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸 为一个酶活力单位。

PG 活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活性定义： 在 40℃, pH6.0 条件下，每克样本每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG 活性（mg/h/g  鲜重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3、按液体体积计算

酶活性定义： 在 40℃, pH6.0 条件下，每毫升培养液每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG 活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反总÷V 样÷T

=2.523×(ΔA+0.008)

4、按细胞数量计算

酶活性定义： 在 40℃, pH6.0 条件下，每 10⁴ 个细胞每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG 活性（mg/h/10⁴ cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T 

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量

V 反总：反应总体积，0.5mL；V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；W ，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

注意事项

煮沸样本建议将样本在沸水中煮沸 10 分钟，以将酶彻底灭活。