葡萄糖脱氢酶试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-105

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GCDH（EC 1.1.1.47 ）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高  等动物的肝脏和弱氧化醋杆菌中。在低聚果糖生产中使用GCDH，不仅能去除低聚果糖中的 葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸与钙离子结合生成的葡萄糖酸钙是一种理 想的补钙制剂。因而，GCDH已成为制备高含量低聚果糖的理想用酶。

测定原理：

GCDH 催化 D-葡萄糖和 NAD 生成 D-葡萄糖酸和 NADH ，在 340nm 下测定 NADH 上升速 率，即可反映 GCDH 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 47.5 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

1、组织的前处理： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1： 5~10  的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；

2、工作液的配制： 临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用； 用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。

3、将工作液置于 37℃预热 5 分钟。

4、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始 吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A2-A1。

GCDH 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min /g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T

=3215×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GCDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=6.43×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1 × 10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³  L / mol /cm； d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL； T： 反应时间， 1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。