果糖 1,6-二磷酸醛缩酶（FDA）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-238

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

植物叶绿体中果糖 1,6-二磷酸醛缩酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶 。催化果糖 1,6-二磷酸和 景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反应，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。

测定原理：

果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，340nm 处吸光值的变化可 反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

试剂组成和配制

提取液一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体×1瓶 ，4℃避光保存；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

天平 、低温离心机 、震荡仪 、研钵 、紫外分光光度计 、 1 ml 石英比色皿。

酶液提取：

1、总 FDA 酶提取：建议称取约 0. 1g 样本，加入 1ml 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s， 间歇 7s，总时间 1min） ，然后 4℃,   8000g 离心 10min，取上清测定。

2、胞浆和叶绿体 FDA 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5～10 的比例（建议称取 约 0. 1g 样本，加入 1ml 提取液一） ，冰浴匀浆后于 4℃,   200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃,   8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 FDA 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min） ，然后 4℃,   8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 FDA 酶活性。

建议测定总 FDA 酶活性 ，按照步骤①提取粗酶液 ，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FDA ，则按照步骤 ② 提取粗酶液。

测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、取 1ml 石英比色皿，依次加入 500μl 试剂一 ， 100μl 试剂二，100μl 试剂三， 100μl 试剂四， 100μl 试剂 五 ，100μl 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2

计算公式：

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

FDA（nmol/min /mg prot）= ΔA÷(ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FDA（nmol/min /g  鲜重）= ΔA÷(ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总)÷T

=321.54×ΔA÷W

3、按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FDA（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷(ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总)÷T

= 321.54×ΔA÷细胞数量

4、按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

FDA（nmol/min /ml）= ΔA÷(ε×d）×V 反总÷V 样÷T

=321.54×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1ml；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol /cm；d： 比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0. 1ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓 度 ，mg/ml；W：样本质量，g