维生素 B6 试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-282

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

维生素 B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理：

VB6 与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm 有特征吸收峰。

试剂组成和配制

提取液：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1 瓶 ，4℃保存。

试剂二： 液体 12mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 18mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 18mL×1 瓶，4℃避光保存。

自备仪器和用品：

天平 、研钵 、离心机 、可见分光光度计 、恒温水浴锅 、 1 ml 玻璃比色皿 、蒸馏水。

样本处理：

1、组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g，加入 0.6ml 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4ml，混匀后于 25℃,   16000rpm 离心 10min，取 上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心 20-30 分钟）。

2、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 0.6ml  提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒 ，间隔 7 秒，总时间 3min）；加蒸馏水 0.4ml， 混匀后于 25℃,   16000rpm 离心 10min，取上清测定。

3、血清：直接测定。

测定操作：

计算公式：

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R² = 0.9986

1、按照蛋白含量计算

VB6 含量( μg/mg prot）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×Cpr） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ Cpr

2、按照样本质量计算

VB6 含量( μg/g）= (△A - 0.0205）÷ 0.36359 ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ W

3、按照细胞数量计算

VB6 含量( μg/10⁴ cell）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总） 

= 13.76×(△A - 0.0205）÷ 细胞数量

4、按照液体体积计算

VB6 含量( μg/ml）= (△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷V 样 

= 13.76×(△A - 0.0205）

V 反总：反应总体积，1ml；：V 样：加入样本体积，0.2ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；  Cpr：蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g

注意事项：

1、若测定结果中吸光值超过 1 ，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2、蛋白浓度较高的样品， 比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式 中乘以稀释倍数。

3、显色完成后立即进行测定。