海藻糖酶（ Trehalase ，THL）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-222

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物 、植物 、微生物和培养细胞中 。海藻糖酶主要功能在于生物体分 解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。

测定原理：

THL 催化海藻糖产生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢；过氧化物 酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰， 以此反映 THL 活性。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 30mL ×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10mL ×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 25mL ×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 25ml ×1 瓶 ，4℃保存；（若出现结冰现象，可 37℃水浴溶解后使用）

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、水浴锅 、可调式移液器 、 1ml 玻璃比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个） ：提 取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液） ，超声波破碎细菌或细 胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S， 间隔 10S，重复 30 次） ；8000g，4℃离心 10min，取上清，置   冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 提取液） ，冰浴中匀浆 。8000g  ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（ml） ：提取液体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议取 0. 1ml 血 清（浆）加入 1ml 提取液），冰浴中匀浆 。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 505nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至 95 度。

3、工作液的配制：使用前将试剂二和试剂三 1:1 等体积混合，用多少配多少。

4、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

45℃水浴，准确反应 15min，95℃水浴 5 分钟终止反应，得混合液(若出现沉淀可 10000g 4℃离心 10min 后取上清)。

混匀，置 37℃（哺乳动物）或 25'C（其它物种）保温 15min 后，于 505nm 波长处读取吸光度 。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管 。每个测定管需设一个对照管。

THL 活力计算：

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.4858x - 0.0042，R² = 0.9999；x 为标准品浓度( μmol/ml），y 为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000 

=366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr

3、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(nmol/min/g  鲜重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 

=366×(ΔA+0.0042)÷W

4、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 

=0.732×(ΔA+0.0042)

5、按血清（浆）体积计算

单位的定义：每 ml 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(nmol/min/ml)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(V 液  ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 

=3660×(ΔA+0.0042)

V 样：加入样本体积：0.09ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；V 反总：反应体系总体积，0.24ml；V 液： 加入血清（浆）体积，0. 1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：