丙酮酸脱羧酶活性测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-143

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

PDC 主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理：

PDC 催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH 还原乙醛生 成乙醇和 NAD+；NADH 在 340 nm 有吸收峰，而 NAD+没有；通过测定 340 nm 光吸收下降 速率，来计算 PDC 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 36mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1 支，﹣20℃保存。

试剂五：液体 60μL×1支，﹣20℃保存。

混合试剂：临用前配制，将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用，用不完的试剂分 装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，工作 3s，间歇 10s，工作 35 次）， 16000g 4℃离心 20min ，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组 织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）等液体样品：直接检测。

PDC 测定操作：

1、分光光度计预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2、试剂二置于 25℃水浴中预热 30 min。

3、依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、100μL 混合试剂、700μL 试剂二和 100μL 试剂六，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2 。计算 ΔA=A1-A2。

PDC 活性计算公式：

1、按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。 

PDC (nmol/min/mg prot) =  ( ΔA÷ε÷d×V 总×10⁹ ）÷(Cpr×V 样) ÷T

=1608×ΔA÷Cpr

2、按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化 1nmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。 

PDC (nmol/min /g 鲜重) =  ( ΔA÷ε÷d×V 总×10⁹ ）÷(W×V 样÷V 样总) ÷T

=1608×ΔA÷W

3、按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC (nmol/min/10⁴ cell) =  ( ΔA÷ε÷d×V 总×10⁹ ）÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T

=1608×ΔA÷细胞数量

4、按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol NADH 氧化为 1 个酶活单位。

PDC (nmol/min /mL) =  ( ΔA÷ε÷d×V 总×10⁹ ）÷V 样÷T

=1608×ΔA

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 总：反应体系总体积，1mL=0.001 L ，V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）， 需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量试剂盒；W：样本质量，g  ；V 样总：加 入提取液体积，1mL；T：反应时间，1 min。