货号：LE-1-239

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1 ，3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油 酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸 光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加 10 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

酶液提取

1、总PGK 酶提取：建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴， 200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 500g 离心 5min ，取上清测定。

2、胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10 的 比例（建议称取约 0. 1g 样本，加入 1mL 提取液），冰浴匀浆后于 4℃ , 500g 离心 5min ，弃 沉淀，取上清在4℃ , 8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后4℃ , 500g 离心 5min ，取上清测定叶绿体中PGK 酶活性。

建议测定总  PGK 酶活性，按照步骤 ① 提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK，则按照步骤 ② 提取粗酶液。

测定操作

1、分光光度计预热 30min ，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。

2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 500μL 试剂一，100μL 试剂二，50μL 试剂三，50μL 试剂 四，200μL 试剂五，100μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2 ，△A=A1-A2

计算公式

1、按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

PGK（nmol/min /mg prot）= ΔA÷ (ε×d） ×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2、按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g  鲜重） = ΔA÷ (ε×d） ×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色 皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0. 1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T ：反应时 间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g