丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-214

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PDH（EC 1.2.4.1）广泛存在于动物 、植物 、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催 化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

测定原理：

PDH 催化丙酮酸脱氢， 同时还原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP） ，从而导致 600nm 光吸收的减少。

产品内容：

试剂一：液体 50ml ×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 10ml ×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1ml ×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 50ml ×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂 ×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂 ×1 瓶，4℃保存；

试剂七：粉剂 ×1 瓶，4℃保存；

试剂八：粉剂 ×1 瓶，4℃保存；

工作液的配制：临用前把试剂五 、试剂六 、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的 试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、水浴锅 、 台式离心机 、可调式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织 、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约 0. 1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g ，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g ，4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PDH（此步可选做）。

5、在步骤 ④ 的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl  试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W ，超声 3 秒，间 隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PDH 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm 处 ，蒸馏水调零。

2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种） 中孵育 5min。

3、在1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 样本和 900μl 工作液，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

PDH 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=905×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH 活性（nmol/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

= 182.8×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 

PDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=0.366×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2. 1×10⁴ L / mol /cm；d： 比色皿 光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间， 1 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。