线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测试盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-299

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

复合体Ⅰ（EC1.6.5.3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH 传递给 CoQ，同时可使O₂还原生 O^2-，是呼吸电子传递链上产生O^2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。

测定原理

复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD⁺，在340nm下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶活性的大小。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂五：1 mL×1 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 2mL 蒸馏水，现配现用；

工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；现配现用；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①  准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②  将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③  弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④  上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。

⑤  步骤 ④ 中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2） 在1mL石英比色皿中加入40μL样本、800μL工作液和60μL试剂六，立即混匀，记录 340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算 ΔA=A1-A2。

复合体Ⅰ活力单位的计算

1、按蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T

=365×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=0.73×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：

比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；

T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。