货号：LE-1-304

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH 位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六， 催化 NADH+NADP⁺ 和 NAD⁺ +NADPH 相互转化。催化正向反应称为 TH-1。线粒体 NADH 含量增加时会导致线粒 体膜的 H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上 ROS 的产生。TH-1 促进 NADH 转换 为 NADPH ，从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代 NADP⁺ ，TH-1 催化 APADP⁺ 还原生成的 APADPH 在 375nm 有特征光吸收，因此通过测定375nm 光吸收增加速率，来计算 TH-1 活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制

试剂一： 液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二： 液体 25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三： 液体 25mL×2 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①   准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一 ，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②   将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③   弃沉淀，将上清液移至另一离心管中， 11000g，4℃离心 10min。

④   上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1（此步可选做）。

⑤    步骤 ④ 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-1 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配制： 临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂 三中混合溶解 ，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 1000μL 工作液，混匀，立即记录 375nm 处初始吸光值 A1 和  10min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A2-A1。

TH-1 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmolAPADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷  (ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T

=164×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmolAPADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性（nmol/min/g  鲜重）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T

=82×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmolAPADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T

=0.164×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1.1×10^-3 L；ε：APADPH 摩尔消光系数，6.7×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL； T： 反应时间， 10  min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g； 500：细菌或细胞  总数，500 万。