线粒体转氢酶-2（TH-2）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-305

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化 NADH+NADP⁺ 和 NAD⁺ +NADPH 相互转化，调节线粒体 NAD(H)和 NADP(H)平衡。把逆向反应称为 TH-2，催化 NADPH 和 NAD⁺ 生成 NADP⁺ 和NADH。

测定原理

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光 度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代 NAD+ ，TH-2 催 化 APAD+还原生成 APADH，APADH 在 375nm 有特征光吸收，测定 375nm 光吸收的增加速 率，来计算 TH-2 活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制

试剂一： 液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二： 液体 25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三： 液体 25mL×2 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①   准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②   将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③   弃沉淀，将上清液移至另一离心管中， 11100g，4℃离心 10min。

④   上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2（此步可选做）。

⑤    步骤 ④ 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于 TH-2 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配制： 临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂 三中混合溶解 ，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2） 在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 1000μL 工作液，混匀，立即记录 375nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A2-A1。

TH-2 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmolAPADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=164×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmolAPADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/g  鲜重）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

=82×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmolAPADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=0.164×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1.1×10^-3 L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T： 反应时间， 10  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。