氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-265

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GSH/GSSG 是细胞内最重要的氧化还原对之一。因此，测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。

测定原理：

利用2-VP 法测 GSSG 含量。

产品内容：

试剂一：液体 50mL×1 瓶， ，4℃保存。

试剂二：液体 300µL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体 30μl×1 瓶 ，-20℃保存 。临用前加入 0.6 ml 试剂三稀释 ，4℃保存。

试剂六：粉剂×1 瓶 ，4℃保存 。临用前加入 40 ml 试剂三溶解 ，现配现用。

自备仪器和用品：

可见分光光度计 、低温离心机 、水浴锅 、可调节移液器 、 1ml 玻璃比色皿和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（ g） ：试剂一体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 试剂 一）进行冰浴匀浆 。8000g 4℃离心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min）待测。

2、细菌 、真菌：按照细胞数量（ 10⁴ 个） ：试剂一体积（ml） 为 500~ 1000： 1 的比例（建议 500 万细胞加 入 1ml 试剂一） ，冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒 ，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离 心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min） 的蒸馏水混匀待测。

3、血清等液体：直接测定。

测定操作:

1、分光光度计预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2、试剂三置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。

3、测定管：取 1 ml EP 管，加入 100μL 上清液，5μL 试剂二，盖紧后混匀，置于 37℃水浴 30min；依次加入 100μL 试剂四， 10μL 试剂五，700μL 试剂六，迅速混匀后，立即测定 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，计算ΔA=A2-A1。

GSSG 含量计算公式:

1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0276x-0.0011；x为标准品浓度（nmol/ml），y为吸光值(ΔA)。

2、按蛋白浓度计算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样×Cpr) 

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

GSSG（nmol /g  鲜重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×W) 

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按细胞数量计算

GSSG（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量) 

=36.23×(ΔA+0.0011)÷细胞数量

5 、按照液体体积计算

GSSG（nmol/ml）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷V 样 

=36.23×(ΔA+0.0011)

V 样：反应中加入样本体积，0. 1ml；V 样总：加入提取液体积，  1ml；W：样品质量，g ，Cpr：样本蛋白浓度（mg/ml）

注意事项：

1、提取过程中去掉蛋白质，所以提取液不能用于测定蛋白含量。

2、临用前配制的试剂配好后 4℃保存，2 天内使用完毕。

3、最低检出限为 0. 1μmol/L。

4、反应温度.严格来说，为保证重复性，应在 25℃下进行反应。

5、反应时间需精确控制，否则会影响反应速率计算，产生较大误差。

6、样品中的 GSSG 浓度尽可能低一些，否则反应速率太大，没法控制，所以稀释倍数要尽量大些。