产品名称:结合态淀粉合成酶(GBSS)测试盒
产品规格:100管/96样,50管/48样,25管/24样
产品货号:YX-W-C405,YX-C-C405-50,YX-C-C405-25
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-C405-25 |
结合态淀粉合成酶(GBSS)测试盒 |
紫外分光光度法 |
25管/24样 |
2000 |
YX-C-C405-50 |
结合态淀粉合成酶(GBSS)测试盒 |
紫外分光光度法 |
50管/48样 |
3200 |
YX-W-C405 |
结合态淀粉合成酶(GBSS)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
6000 |
结合态淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS) 试剂盒说明书(微量法)
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责直链淀粉的合成。
测定原理
GBSS 催化ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成ADP; 进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为 NADPH,其中 NADPH 生成量与前一步反应生成的 ADP 数量呈正比,通过 340nm 下测定 NADPH的增加量,可以计算 GBSS 活性。
自备实验用品及仪器:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 100mL×2 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 14mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 8mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 10mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂五:液体×1 支,-20℃保存;临用前加入 500μ L 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 500μ L 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
粗酶液制备:
称取 0.1~0.2g 组织(建议称取约 0.1g 组织),加入 1mL 提取液,冰浴中匀浆。10000g , 4℃离心 10min,弃上清,在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀,置冰上待测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂
试剂名称(μ L) |
测定管 |
样本 |
75 |
试剂二 |
135 |
混匀,30℃保温 20 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却
试剂三 |
75 |
混匀,30℃保温 30 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却,10000g 25℃离心 10min,取上清液(如果一次性测定样本较多,可以将试剂四、五和六按比例配成混合液)
上清液 |
150 |
试剂四 |
100 |
试剂五 |
5 |
试剂六 |
5 |
混匀后立即 340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算 Δ A=A2-A1。注意:试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。
GBSS 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。GBSS(nmol/min/mg prot)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数
=528×Δ A÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GBSS 活性(nmol/min /g 鲜重)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T× 稀释倍数=528×Δ A÷W
V 反总:反应体系总体积,2.85×10-4 L;ε :NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,2 min;稀释倍数:1.73;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。GBSS(nmol/min /mg prot)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数
=1056×Δ A÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GBSS 活性(nmol/min /g 鲜重)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T× 稀释倍数 =1056×Δ A÷W
V 反总:反应体系总体积,2.85×10-4 L;ε :NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm; d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL; T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.73;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。
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