产品名称:己糖激酶(HK)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-B200,YX-W-B200
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-C200 |
己糖激酶(HK)测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
350 |
YX-W-C200 |
己糖激酶(HK)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
680 |
产品内容:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体20mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;
测定意义
HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。HK 催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH,NADPH 在340nm 有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一 、样本的前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min, 取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
① 在试剂二中加入18mL 试剂一充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min; 用不完的试剂4℃保存一周;
② 在试剂三中加入1mL 试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一周;
③ 在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、10μL 试剂三和180μL 试剂二,混匀,立即记录340nm 处20s 时的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
注意:不同匀浆组织中HK 活力不一样,做正式试验之前请做1-2 只预试,若ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
HK 活性计算
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)HK 活性
单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=643×ΔA 2、组织、细菌或细胞中HK 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b. 用96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)HK 活性
单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=1286×ΔA 2、组织、细菌或细胞中HK 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。
HK(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总
数,500 万。
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