β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

注意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体 65mL×1 瓶，4℃保存，若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 35mL 蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解。

标准品：粉剂×1 支，10mg 无水葡萄糖。

产品说明：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4 糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品中可溶性糖的提取：

称取约 0.1g 样本，加入 0.8mL 蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取 15min，每 5min 振荡 1 次，使其充分提取；6000g，常温离心 10min，取上清液加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 双蒸水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。

二、测定操作表：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、 将葡萄糖标准液稀释为 0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078 和 0.0039mg/mL 的标准溶液。

3、 按操作表依次加入各试剂：

70℃水浴 15min 左右，冷却

在 40℃恒温水浴中准确保温 5min

混匀，90℃水浴 10min，在 540nm 下测定吸光度，从左到右分别记为 A1、A2、A3、A4、A5 和 A6， 计算∆Aα=A2-A1，∆A 总=A4-A3，∆A 标准=A6-A5。

酶活性计算：

1、 标准曲线的绘制

以∆A 标准为 y 轴，以标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到方程 y=kx+b。将∆Aα测定带入方程得到 x₁（mg/mL），∆A 总代入方程得到 x₂（mg/mL）。

2、α-淀粉酶活性
a. 按照样本质量计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(mg/g 鲜重)=x1×V 样÷(W×V 样÷V 样总)÷T =2×x1÷W
b. 按照蛋白质含量计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。
α-淀粉酶活性(mg/mg prot)=x1×V 样÷（V 样×Cpr）÷T = 0.2×x1÷Cpr 

3、总淀粉酶活性计算
（1） 按照样品质量计算
单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1  个酶活力单位。总淀 粉 酶 活 性 (mg/g 鲜重 )=5×x2×V 样÷(W×V 样 ÷V 样总) ÷T=10×x2÷W
（2） 按照蛋白质含量计算
单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。总淀粉酶活性(mg/mg prot)= 5×x2×V 样÷（V 样×Cpr）÷T = x2 ÷Cpr

4、β-淀粉酶活性计算
（1） 按照样品质量计算
单位定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。β-淀粉酶活性（U/g 鲜重）＝淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性=（10×x2÷W）-（2×x1÷W）
=（10×x2-2×x1）÷W
（2） 按照蛋白质含量计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。β-淀粉酶活性（U/mg prot）＝淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性
=（x2÷Cpr）-（0.2×x1÷Cpr） 5：总淀粉酶稀释倍数，（4mL+1mL）/1mL=5； V  样：加入反应体系中样本体积，0.25 mL；V  样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W ：样本质量，g；T：反应时间， 5min。
注意事项
测定的吸光值大于 1 时，可以对样本进行适当稀释后测定。