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产品名称:乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒

产品规格:50管/24样,100管/48样

产品货号:YX-C-B411,YX-W-B411

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

YX-C-B411

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒

可见分光光度法

50管/24

850

YX-W-B411

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒

微量法

100管/48

1600

乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)活性检测试剂盒说明书(可见分光光度法

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品简介:

乙酰辅酶 A 羧化酶Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物体内催化乙酰辅酶 A 羧化生成丙二酰辅酶 A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC 的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO3  ATP 生成丙二酰辅酶 A、ADP 和无机磷,钼蓝与磷酸根生 660nm 有特征吸收峰的物质,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。

试验中所需的仪器和试剂:

可见分光光度计、天平、低温离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。

产品内容:

提取液一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

提取液二:液体 0.6mL×1 支,-20℃避光保存;

试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 12.5mL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 6mL 双蒸水,充分溶解待用;可分装后-20℃保存, 避免反复冻融;

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;

试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;

试剂六:液体 15mL×1 瓶,室温保存;

标准品:10μmol/mL 标准磷贮备液 1mL×1 支,4℃保存;

提取液的配制:按提取液一:提取液二=990:10(V:V)的比例配制,根据样本量现配现用, 禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。

工作液定磷剂的配制: H2O:试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的工作液应为浅黄色。若变色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,工作液应现配现用。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染

操作步骤:

一、粗酶液提取:

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量104 个):按照细菌或细胞数量(104  个):提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离 10min,取上清置于冰上待测。

血清(浆):直接测定。

二、测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。

2、 将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液备用。

3 操作表:( 1.5ml 离心管中依次加入下列试剂)

酶促反应:

试剂名称

对照管

测定管

试剂一(µL

450

 

试剂二(µL

-

250

试剂三(µL

-

200

样本(µL

50

50

37℃(哺乳动物) 25℃(其它物种)准确反应 30min 后,沸水浴 5min(盖紧, 以防止水分蒸发散失,冷却后,10000g 25℃离心 5min,取上清

定磷反应:

试剂名称

标准管

空白管

对照管

测定管

标准溶液(μL)

100

-

-

-

H2O(µL)

-

100

-

-

上清液(µL)

-

 

100

100

工作液(µL)

900

900

900

900

混匀,37℃(哺乳动物 25℃(其它物种反应 30min,冷却至室温,在 660nm 处,蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,分别记为 A 标准管、A 空白管、A 对照管和 A 测定管。ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。标准管、空白管只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。

三、ACC 活性计算

1、 标准曲线的绘制:

以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将ΔA 带入方程得到 x(μmol/mL)

2、 ACC 活性的计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活定义:每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位

ACC 酶活(U /mg prot)=x×V 总÷(V 样×Cpr)÷T=20x÷Cpr。

(2)按样本质量计算

酶活定义:每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活(U /g 鲜重)=x×V 总÷(V 样×W÷V 样总)÷T=20x÷W。

(3)按照细菌或细胞数量计算

酶活定义:每小时每 104 个细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活(U /104 cell)=x×V 总÷(V 样×细胞数量(万个)÷V 样总)÷T=20x÷细胞数量(万个)。

(4)按液体体积计算

酶活定义:每小时每 mL 液体产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC 酶活(U /mL)=x×V 总÷V 样÷T=20x。

V 总:酶促反应总体积,0.5mL;V 样:加入样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本鲜重,g。

注意事项

1、 工作液(定磷剂)应现配现用,正常颜色为浅黄色,如有变色或变蓝则均为失效。

2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。

3、 显色结束后应立即检测。

4、 当ΔA 大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。


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