中性转化酶（NI）活性检测试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

规格：100T/48S

产品内容：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存;

试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存;

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 20mL 试剂一充分溶解备用；

试剂三：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

标准品：粉剂×1 支，4℃保存，10mg 无水葡萄糖；临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,制备 10mg/mL葡萄糖标准液备用。

产品简介：

蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，将高等植物 Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。NI 主要存在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。

NI 催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm 有特征光吸收，在一定范围内 540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算 NI 活性

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

一、粗酶液提取：

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；12000g，4℃，离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、标准曲线绘制

将标准液用蒸馏水稀释为 2、1.5、1.0、0.5、0.25 mg/mL 葡萄糖标准液，按照测定步骤分别测定2、1.5、1.0、0.5、0.25、0 mg/mL 葡萄糖标准液在 540nm 下的吸光度（A），以各浓度下吸光值减空白管（浓度为 0mg/mL）的吸光度为 y 轴，葡萄糖浓度为 x 轴绘制标准曲线。

三、测定步骤和加样表：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，（在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）：

四、注意事项：

1、如果加入试剂三，煮沸 10min 后有混浊物出现，建议离心除去沉淀后，取上清测定吸光度；

2、如果吸光值大于 1，可以用蒸馏水将样本稀释后测定（计算公式中乘以相应稀释倍数）

五、NI 活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y=kx+b；x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。

1、按蛋白浓度计算

单位定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1µg 还原糖定义为一个酶活性单位。

NI 活性（U/mg prot）=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3 ×x÷Cpr

2、按鲜重计算

单位定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1µg 还原糖定义为一个酶活性单位。

NI 活性（U/g）=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3 ×x÷W

1000：1 mg/mL =1000µg/mL ；V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；T：反应时间：30min。