α-葡萄糖苷酶 (α-GC）试剂盒说明书（分光光度法 ）

货号：LE-1-107

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物 、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖基之间的 α-糖苷键生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些信号分子产生密切相关。

测定原理：

α-GC 分解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸 光值升高速率来计算α-GC 活性。

试剂组成和配制：

提取液：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 10ml 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃ 保存。

试剂二：液体 25 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（ 10⁴ 个） ：提 取液体积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液） ，超声波破碎细菌或细 胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次） ； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰 上待测。

2、组织：按照组织质量（ g）：提取液体积(ml)为 1 ：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1ml 提取 液） ，进行冰浴匀浆 。 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、加样表

充分混匀，放入 37℃准确水浴 30min 后，立即放入 95℃水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失） ，流水冷却 后充分混匀（以保证浓度不变） ，8000g，4℃,   离心 5min，取上清液

充分混匀，室温静置 2min 后，  400nm 处测定吸光值 A ，计算ΔA=A 测定管-A 对照管 。每个测定管需设一个对照管。

α-GC 活力计算：

标准条件下测定的回归方程为 y =0.00543x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/ml） ，y为吸光值。

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GC 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GC 活力(nmol/min /g 鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GC 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T 

=0. 123×(ΔA +0.0027)

V 反总：反应体系总体积，1ml；V 样：加入反应体系中样本体积，0. 1ml；V 样总：加入提取液体积，1ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。