海藻糖酶（Trehalase，THL）试剂盒说明书（微量法）

规格：100T/48S

产品说明：THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。

采用 3.5－二硝基水杨酸法测定 THL 催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与 3.5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断 THL 活性的高低。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶 ，4℃保存，用时加入 2mL 试剂一，充分溶解待用； 

试剂三：液体 13mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：液体 13mL×1 瓶，常温保存；

标准品：粉剂×1 支，4℃保存，含 10mg 无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入 1ml 蒸馏水溶解备用，4℃可保存 1 周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至 1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml。

操作步骤：

一、样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液充分匀浆以破碎并裂解细胞（功率 20％，超声 3S 秒，间隔 10S，重复 30 次）；8000g， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。8000g ，4℃下离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）的处理：吸取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。8000g  ，4℃下离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至 95 度。

3、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）：

混匀， 100℃煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中测定 540nm 处测定管吸光值。计算ΔA=A 测定-A 对照。

每个测定管均需设立一个对照管。

根据标准管浓度和吸光度建立标准曲线，x 为吸光度，y 为标准品浓度（mg/mL）。

THL 活力计算：

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力（U /mg prot）＝1000× y÷÷T÷Cpr =100× y ÷Cpr 

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力（U /g 鲜重）＝1000×y÷T÷(W÷V 样总)=100 ×y÷W 

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力（U /104 cell）＝1000×y÷T÷(500÷V 样总)=0.2 ×y 

4、按血清（浆）体积计算

单位的定义：每 mL 血清（浆）在反应体系中每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(U/mL)=1000×y÷T÷(V 样÷V 样总)=1000×y。

1000：1mg/mL=1000µg/mL；T：反应时间，10min；V 样：加入血清（浆体积），0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。