注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体 60mL×1 瓶 ，4℃保存；

试剂二：液体 0.6mL×1 支，-20℃保存；

试剂三：液体 55mL×1 瓶 ，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂八：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加入 2mL 双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍 -20℃保存。

工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

产品说明：

α-KGDH （EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调 控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。

α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶A 、二氧化碳和 NADH ，NADH 在340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、 可调式移液器、 1mL 石英比色皿、 研钵、 冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、α-KGDH 的提取

称取约 0. 1g 组织或收集约 500 万细胞， 加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂二，冰浴用匀浆器或研钵 充分研磨，4 ℃ 11000 g 离心 10min ，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1.   分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零

2.   空白管：

取 1mL 工作液加入 1mL 石英比色皿，37℃孵育 5min 后取出比色皿，再依次加入 40μL 试剂八 和 60μL 蒸馏水，混匀并立即测量 340nm 处 0s 的吸光值 A1 ，37℃准确反应 2min ，记录 340nm 处 2min 时的吸光值 A2 ，计算ΔA 空白=A2-A1。

3. 测定管：

取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA 测定=A4-A3。

三、α-KGDH 活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义： 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH 活性（U/mg prot）＝[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷（ε×d）×V 反总×109]÷(Cpr×V 样) ÷T =1473.7×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义： 每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

α-KGDH （U/g  鲜重） ＝[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷ （ ε×d）×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T

=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义： 每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单 位。

α-KGDH 活性（U/104cell）＝[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷ （ ε×d）×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×500)    ÷T

=2.977×(ΔA 测定-ΔA 空白)

V 反总： 反应体系总体积，1. 1×10-3 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色 皿光径，1cm ；V 样： 加入样本体积，0.06mL；V 样总： 加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T： 反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意事项：

1 、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2 、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃ ，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水， 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3 、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4 、测定管的ΔA 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的ΔA 值大于 0.25 ，需将样本进行稀释。