产品名称:NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:LE-1-336,LE-2-336
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
LE-1-336 |
NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒 |
分光光度法 |
50管/48样 |
320 |
LE-2-336 |
NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
600 |
货号:LE-1-336
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键 酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间 产物,连接多条重要的代谢途径。因此 ,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的 能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为 NAD- 依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH ,NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。
测定原理:
NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:提取液 60 mL×1 瓶,在 4℃保存;试剂二:液体 50 mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂三:粉剂×2 支,-20℃保存; 临用前加入 300μL 蒸馏水; 用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻 融。
试剂四:粉剂×2 支,-20℃保存; 临用前加入 300μL 蒸馏水; 用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻 融。
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试 剂一体积(mL)为 500~1000: 1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细 胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1 :5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一), 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、将试剂二在37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
3、操作表:
试剂名称 (μL) |
测定孔 |
样本 |
20 |
试剂二 |
760 |
试剂三 |
10 |
试剂四 |
10 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5 ,可提高检测灵敏度。计算公式中乘 以相应稀释倍数。
NADP-MDH 活力单位的计算:
1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d)×109]÷V 样÷T
=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
NADP-MDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ ( ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×500)÷T
=12.86×ΔA
V 反总:反应体系总体积,8×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm; V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积 ,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; 500:细胞或细菌总数,500 万。
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