线粒体 H+-ATP 酶试剂盒说明书（分光光度法）

测定意义：

线粒体 H+-ATP 酶的功能主要是合成 ATP  和转运 H+，在线粒体呼吸链中耦联 ATP  的合成，为机体提供能量。 

测定原理：

H+-ATP  酶水解 ATP 产生 ADP 和无机磷，通过测定无机磷增加速率来测定 H+-ATP  酶活性。 

需自备的仪器和用品：

分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水，充分溶解待用。 

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 3mL 蒸馏水，充分溶解待用。 

试剂七：液体 6mL×1 支，4℃保存。

试剂八： 粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水溶解。用不完的试剂 4℃保存。

试剂九： 粉剂×3支，4℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水溶解。现配现用。

定磷试剂的配制：取 EP 管一支，加入 660μL 试剂七，再加入 100μL 试剂八，充分混匀后， 再加入 240μL 试剂九，充分混匀待用。配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效， 若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少，现配现用）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿， 以避免磷污染。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1 、 准确称取 0. 1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL  试剂三，用冰浴匀浆 器或研钵匀浆。

2 、 将匀浆 600g ，4℃离心 5min。

3 、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g ，4℃离心 10min。

4 、 步骤 3 中的沉淀即为线粒体，加入 200μL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 3s ，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 H+-ATP 酶活性测定。

测定步骤：

1 、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm ，蒸馏水调零。

2 、 样本测定

在 EP 管中加入如下试剂

在 96 孔板中加入下列试剂

混匀，静置 10min 后，在 660nm 处读取 A 测定管和 A 对照管，计算ΔA=A 测定管-A 对照 管。

H+-ATP 酶活力单位的计算：

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.4746x - 0.0036，R2  = 0.9967；x 为标准品浓度(μmol/mL）， y 为ΔA 值。

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol  无机磷定义为一个酶活性单位。

H+-ATP 酶活性（nmol/min /mg prot）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×1000=386.29× (ΔA+0.0036) ÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol  无机磷定义为一个酶活性单位。

H+-ATP 酶活性（nmol/min /g  鲜重）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反总÷(W× V 样÷V 样总) ÷T×1000 =77.25× (ΔA+0.0036) ÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol  无机磷定义为一个酶活性单位。

H+-ATP 酶 活性（ nmol/min /10⁴  cell ）=(ΔA+0.0036)÷0.4746×V 反 总 ÷(500×V 样 ÷V 样 总) ÷T×1000=0. 155×(ΔA+0.0036)

V 反总：反应体系总体积，0.275mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取 液体积，0.2 mL；T ：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量， g；500：细胞或细菌总数，500 万。