亚铁氧化酶（HP）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-391

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Hephaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶，HP 属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP 的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP 催化 Fe²⁺ 氧化生成  Fe³⁺ ，在介导铁的跨膜转运中有重要作用。

测定原理：

HP 催化 Fe²⁺ 氧化为  Fe³⁺ ， Fe²⁺ 和 ferrozine 反应显色，在 560 nm 下有特征吸光值。通过测定 Fe²⁺  的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存;

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存;

试剂三：液体 30 mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：水 mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 蒸馏水）， 进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 560 nm ，蒸馏水调零。

2、在玻璃比色皿中加入下列试剂

HP 活性计算:

标准曲线：y = 16.427x - 0.0006 ，R²  = 0.9998；(x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值 ΔA) 

1、按样本质量计算

单位定义：每 g 样本每分钟氧化 1nmol Fe²⁺ 定义为一个酶活力单位。

HP（nmol/min/g  鲜重）= (△A+0.0006）÷16.427×V 总÷T ÷(W×V 样÷V 样总)×1000

= 20.29×(△A+0.0006）÷W

2、按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 蛋白每分钟氧化 1nmol Fe²⁺ 定义为一个酶活力单位。

HP（nmol/min/mg prot）= (△A+0.0006）÷ 16.427×V 总÷T ÷（Cpr×V 样）× 1000

= 20.29×(△A+0.0006）÷Cpr

V 总：反应体系体积，0.1 mL；V 样：加入样本体积 0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；1000 ，μmol 到 nmol 的转换系数。